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Programa Académico de Biología | Departamento de Biología | Facultad de Ciencias | Oficina de Asuntos estudiantiles
Grupo de Estudio y Trabajo en Genética
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II Seminario Tópicos actuales de investigación en Genética
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II SEMINARIO DE TÓPICOS ACTUALES DE INVESTIGACIÓN EN GENÉTICA

Genética Humana e Inmunología


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AUTORES: Bravo M; Díaz M.L ; García L.B; Y Muñoz S
TITULO: Desarrollo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del virus del papiloma humano
EXPOSITORA: Dra. Liz Betty García
INSTITUCION: Laboratorio Inmunología y Enfermedades Infecciosas y Departamento Patología Facultad Ciencias de la Salud - Universidad del Cauca.

El CCU relacionado con VPH es segundo cáncer más común y causa principal de mortalidad femenina en países en desarrollo, La detección de VPH mediante PCR es, superior a la hibrida y hace posible tipificar el virus. Este trabajo muestra la estandarización del PCR en el laboratorio de Inmunología y Enfermedades Infecciosas de la Universidad del Cauca.
Se tuvo como objetivo Estandarizar una técnica de PCR casera para detectar VPH en biopsias cervicales parafinadas. Se utilizó biopsia cervical uterina parafinada positivo par VPH histológicamente. Cultivo de células SiHa - HPV16 positivas para control positivo. Iniciadores GP5 :5´ y GP6 :Extracción de ADN con 3 protocolos: 1. Desparafinización con xilol y extraccióncon proteinasa K (PK). 2. Desparafinización y extracción con PK, precipitación con cloroformo - isoamílico. 3. Desparafinación y hervida a 95ºC por 10 min. Para amplificación se probó TAQ polimerasa (1.5, 1 y 0.5Uds) y diferente cantidad de oligonucleótidos iniciadores. Detección mediante electroforesis teñida con bromuro de etidio. Los mejores resultados se obtuvieron con PK, cloroformo isoamílico, 25 pm de cada iniciador y 1 unidad de TAQ polimerasa por muestra.
Conclusiones.
Se estandarizó un PCR casero para ADN del VPH la cual produce mejores resultados mediante el tratamiento con PK y purificación con cloroformo-isoamílico.y amplificaión con 25 pmol de cada iniciador y 1 unidad de Taq polimerasa.
AUTORES: Diaz L ; Barreto G
TITULO: Niveles de expansión del trinucleótido CGG en diferentes generaciones de una gran familia con el síndrome de X frágil
EXPOSITORA: Lucy Milena Díaz - Tesista Biología
INSTITUCION: Laboratorio de Biología Molecular en humanos, Sección de Genética, Dpto. de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Valle.

El síndrome del cromosoma X frágil (SXF) es la primera causa de retraso mental hereditario que se transmite como un trastorno mendeliano de tipo dominante ligado al cromosoma X con penetrancia reducida. Molecularmente el SXF está causado por una mutación que incrementa el tamaño del trinucleótido (CGG)n en la región 5'del primer exón del gen FMR-1. El objetivo de este trabajo se centro, en definir los niveles de expansión del trinucleótido CGG en varias generaciones dentro de una misma familia. Para esto se estudiaron 50 individuos pertenecientes a una gran familia con varios de sus miembros afectados y presentando características propias del síndrome.
Para el diagnostico del grupo familiar se utilizaron tres metodologías diferentes basadas en PCR, donde cada una de ellas presento diversos niveles de eficiencia cuando se trata de definir individuos normales, portadores de la premutación o de la mutación completa. Con la metodología 1 se obtuvo 35 normales 11 con premutaciones y 3 con mutación total, con la metodología 2, 15 normales, 34 premutados y con la metodología 3, 23 normales, 25 portadores de la premutación. Se observo expansión del triplete CGG en 26 pacientes cuantificados entre 2 a 98 repeticiones; 8 pacientes en los cuales la expansión permaneció constante y 5 pacientes en los cuales disminuyo.
Definir como se Transmite los niveles de expansión en términos cuantitativos a través de varias generaciones, permitirá valorar el nivel de variabilidad interpoblacional y además tendrá importantes implicaciones para el asesoramiento genético de estas familias.
AUTORES: Díaz M.L ; García L.B.; Rodríguez E.L.
TITULO: Estandarización y aplicación de PCR casero para identificación de pacientes on tuberculosis (TBC).
EXPOSITORA: María Lilia Díaz.
INSTITUCION: Laboratorio de Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Universidad del Cauca, Popayán - Colombia

Este trabajo tiene como objetivo Estandarizar una prueba de PCR casera para identificar ADN del Complejo Mycobacterium tuberculosis (M.tb) en cultivo y en diferentes muestras clínicas líquidas y biopsias.valorando la sensibilidad y especificidad comparándola con el diagnóstico microbiológico y clínico y muestras de pacientes sin TBC.Se amplificó un fragmento de 245 pb de IS6110 presente en el Complejo M.tb con los cebadores INS1 e INS2 en ADN extraído de cultivos de micobacterias, otros microorganismos y una variedad de muestras clínicas sospechosas deTBC. Los pacientes se clasificaron como TBC establecida, probable o no TBC ciegamente con respecto al PCR. Se determinó la cantidad mínima deADN amplificable procedente de cultivo de M.tb, de muestra líquida y de biopsia. También la especificidad en ADN de otras micobacterias no TBC, hongo, bacteriaaerobia y linfocitos humanos. Se aplicó luego a diversas muestras clínicas depacientes con sospecha de TBC y pacientes controles. Los resultados demostraron que la prueba detecta 1 fg de ADN de cultivo de M.tb, 1 pg de ADN delíquido corporal ZN negativo, cultivo positivo y 1 pg de ADN de biopsia ZN negativo, cultivo positivo En la aplicación de la prueba se evaluaron 154 pacientes 23 TBC establecida, 45 TBC probable y 48 sin TBC. El PCR fue positivo en 22 (95.6%), 34 (75.5%) y 2 (4.3%) respectivamente. 38 fueron indeterminados. En 64 muestras líquidas y 33biopsias procesadas para PCR 33 (51.5%) y 32 el (96.9%) fueron PCR positivas. De 119 cultivos y 82 ZN de líquidos 26 (21.8%) y 11(13.4%) respectivamente fueron positivos. De 14 cultivos y ZN de biopsias 964.2%) y 2 (14.3%) respectivamente fueron positivos. Nuestra prueba casera de PCR es altamente sensible pues detectaM.tb en cantidades mínimas de ADN como 1 fg procedente de cultivo y 1 pgprocedente de muestra clínica. Es específica pues es positiva solamente enmicobacterias del complejo M.tb. Es realizable en una variedad de muestrasclínicas y en nuestro medio. La PCR se demora sólo 2 días y puede establecer eldiagnóstico mientras la micobacterias crecen en el cultivo lo cual puede demorar hasta 2 meses. De otro modo en las formas de TBC paucibacilar en as que la microbiología es negativa nuestra prueba puede establecer el diagnóstico en el77% con una especificidad del 95%.
AUTORES: Cifuentes L., Bonilla VE, Barreto G.
TITULO: Caracterización de poblaciones indígenas, Afroamericanas y Mestizas, mediante el uso de 6 sistemas de STR's
EXPOSITORA: Laura Fernanda Cifuentes Bióloga
INSTITUCION: Universidad del Valle, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Sección de Genética, Laboratorio de Biología Molecular en Humanos.

Por su alto grado de polimorfismo lo s STR's se constituyen en una herramienta fundamental para el análisis molecular de relaciones familiares e identificación de individuos. Para aplicar estas tecnologías de manera adecuada, es de suma importancia determinar para cada población las frecuencias alélicas para los diferentes sistemas.
Con el fin de establecer las frecuencias alélicas generadas por 6 sistemas de STR's e intuir el grado de mezcla racial, fueron estudiados 50 individuos Afro-Americanos, 90 individuos de 2 comunidades indígenas y 50 mestizos.
A partir de lo cual se logro para cada uno de los sistemas TH01, D7S820, D13S317, vWA, FGA y F13 A01, definir la frecuencia de los diferentes alelos, además del grado de mezcla racial en las poblaciones analizadas.
AUTORES: Satizabal J; Erazo M; Montoya J; Solorzano M; Herrera E; Velez O; Lopez P.
TITULO: Tamizaje neonatal de hipotiroidismo congénito en Colombia ¿que muestras utilizar?.
EXPOSITOR: José María Satizabal MD.
INSTITUCION: Universidad del Valle, Laboratorio de Enfermedades Congénitas del Metabolismo; Departamento de Ginecología y Obstetricia, Clínica Rafael Uribe ISS Cali Colombia
jmsatizabal@latinmail.com

Para el tamizaje neonatal del hipotiroidismo congénito (H.G) la O.M.S. Recomienda utilizar muestras de sangre de talón (tercer - sétimo día de post parto); la Academia Americana de Pediatría al momento de la alta hospitalaria (generalmente después de 48 horas en países desarrollados); en Colombia la resolución 00412 /2000 indica que debe hacerse del cordón umbilical al nacimiento. Nuestro trabajo tuvo como objetivo establecer el momento óptimo de muestreo para el tamizaje neonatal de H.G. En la ciudad de Cali-Colombia .la población utilizada fueron 100 neonatos (con programa de control neonatal) y 100 neonatos del Hospital Universitario del Valle H.U.V.(sin control neonatal).Se determino la concentración de hormona TSH (microelisa ICN-Pharmaceuticals) en muestras de sangre tomadas de: cordón umbilical talón de alta hospitalaria, después de 48 horas de nacidos se correlacionaron utilizando una prueba de t student´'s.
Los resultados de las muestras de cordón umbilical para la clínica Rafael Uribe (5.43 ± 2.97), H.U.V. (5.07 ± 3.94) y 0 positivos para el talón de alta hospitalaria en la clínica Rafael Uribe (8.63 ± 6.15), H.U.V. (6.64 ± 4.07) y 4 positivos para el talón después de 48 horas de nacido, en la clínica Rafael Uribe (1.86 ± 2.45), H.U.V. (2.19 ± 1.1) y 0 positivos. El porcentaje de retorno 848 horas) en la clínica Rafael Uribe 52, H.U.V. 16.
Se concluye que las muestras de cordón umbilical y talón a 48 horas correlacionan estadísticamente; dado el poco tiempo de estancia hospitalaria posparto, el bajo porcentaje de retorno (menor cobertura9, mayores falsoso positivos y dificultades técnicas para la toma de la muestra de talón, recomendamos utilizar las muestras de cordón umbilical para el tamizaje en Cali.
AUTOR: Klinger J.
TITULO: Células dendríticas y vacunas de ADN.
EXPOSITOR: Julio Cesar Klinger MD.
INSTITUCION: Laboratorio de Investigaciones Inmunológicas e Infecciosas. Facultad Ciencias de la Salud - Universidad del Cauca - Popayán - Colombia.

Las células dendríticas (DC) inician y regulan la respuesta inmune localizadas inicialmente entre la piel y mucosas, capturan los antígenos (Ag) que lesionen los tejidos y migran a las áreas paracorticales de los ganglios linfáticos más próximos para presentar los antígenos a las células T y B vírgenes seleccionado las más específicas contra el Ag presentado.
Además de presentar antígenos la DCs regulan la respuesta inmune especifica dirigiendo a través de citoquinas y moléculas co-accesorias la inducción de respuesta TH1, TH2, la producción de anticuerpos y el desarrollo de tolerancia.
El mejor conocimiento de las DCs es un promisorio campo de la inmunobiología para en tender y ofrecer soluciones terapéuticas en trasplante, alergias, tumores, auto-inmunidad e infecciones virales (Ejemplo: VIH y sarampión).
Por otro lado es ya bien establecido que secuencias de ADN insertado en plásmidos y aún ADN libre estimulán respuestas inmunes celulares y humorales especificas, especialmente del tipo Th1 y células CD8 a ser presentadas eficientemente por las DCs.
Estos y otros hechos hacen de las células dendríticas un fértil y promisorio campo de investigación biomédica.
AUTORES: Díaz M.L, García L.B, Muñoz S, Vasquez R, Dulcey I.
TITULO: Reacción en cadena de la polimerasa PCR casera para ADN de Toxoplasma gondii : estandarización.
EXPOSITORA: Dra Sulma Muñoz Benitez.
INSTITUCION: Laboratorio de Inmunología y Enfermedades Infecciosas Universidad del Cauca. Popayán-Colombia.

La toxoplasmosis es una de las principales causas de abortos y malformaciones en los fetos cuando la infección se adquiere durante el embarazo. Igualmente produce encefalitis y retinitis en pacientes infectados por VIH y enfermedad en inmunosuprimidos por transplante de órganos. El diagnóstico en nuestro medio actualmente se basa en la identificación de IgG en presencia de Ig.M..Esta metodología presenta dificultades de interpretación tanto en las embarazadas como en los inmunocom prometidos, donde el diagnóstico de la infección aguda y actividad de la enfermedad son de vital importancia para laconducta terapéutica.
La metodología del PCR ha sido utilizada para buscar ADN de agentes infecciosos en diversas muestras clínicas entre ellas el PCR para Toxoplasma gondii. l presente trabajo muestra la estandarización en nuestrolaboratorio de una técnica de PCR con iniciadores B1 y B4 para la identificación del ADN de este microorganismo. Se utilizaron iniciadores Bl y B4 cuyas secuencias son para B1 5´-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3`y para B4 5'-CTTAAAAGCGTTCGTGGTC-3` y ADN extraído de líquido peritoneal y biopsia fresca de peritoneo de ratón suizo albino inoculado con la cepa RH de Toxoplasma gondii, donada por el Departamento de Parasitología de la Universidad de Antioquia. La inactivación de las muestras se realiza con alcohol absoluto. Se extrae el ADN con SDS y Proteinasa K, se purifica con Cloroformo isoamílico y se precipita con alcohol absoluto en presencia de acetato de Na, El mejor protocolo de amplificación fue utilizando 30 pmoles deiniciadores,5  l de Buffer TE l0X, 5  l de mezcla de dinucleotidos fosfatados a 2.5 mM cada uno, 7 l de ClMg a 25 mM, 0.5 g de formamida, una unidad de taq polimerasa, 45 ciclos con una Tº de hibridizaciónde 54 ºC. Este protocolo mostró el fragmento de 174 pb esperado en la muestrapositiva hasta con l ngr de ADN total y fue específico ya que la biopsia control negativo no mostró el fragmento.
Conclusión: Con este PCR casero es posible realizar la amplificación del ADN de toxoplasma con una buena sensibilidad hasta de 1 ngr y en forma específica. Es necesario diseñar un estudio para aplicar esta metodología a la identificación de pacientes y fetos infectados por toxoplasma durante el embarazo y otrospacientes con enfermedad sugestiva de toxoplasma.
AUTOR: Saavedra L.
TITULO: Efecto de compuestos químicos Xenobíoticos sobre la síntesis y secreción de vitelogenina en hembras del lagarto tropical Anolis pulchellus mantenidas en cautiverio
EXPOSITORA: Lorena Saavedra Rodríguez, Bióloga.
INSTITUCION: Universidad de Puerto Rico-Universidad del Valle.

Las proteínas de la yema o vitelo de los vertebrados que ponen huevos, se derivan de un precursor sintetizado en el hígado conocido como Vitelogenina. Durante el cautiverio, las hembras de la especie Anolis pulchellus exhiben severas reducciones en la síntesis de vitelogenina, las cuales son revertidas o contrarrestadas por el tratamiento con estrógeno. Se cree que ciertos compuestos químicos naturales y artificiales pueden actuar estrogénicamente y afectar el sistema endocrino de los organismos vivos, alterando la expresión de las proteínas reguladas hormonalmente. La vitelogenina es una de ellas, y al ser producida exclusivamente por las hembras bajo el control del estrógeno, es considerada un biomarcador adecuado para evaluar el potencial estrogénico de contaminantes ambientales. El objetivo de esta investigación es determinar si las sustancias químicas como Glifosato (Ingrediente activo principal del herbicida Roundup), DDT, DDE y Methoxychlor (Pesticidas mundialmente usados para el control de insectos), causan efectos similares al estrógeno en las hembras cautivas de Anolis pulchellus y elevan o restablecen los niveles de vitelogenina en el plasma y los niveles de su RNA mensajero (mRNA) en el hígado, que habían sido reducidos por el estrés del cautiverio. Los posibles efectos son definidos a nivel molecular mediante técnicas de Electroforesis, Western blot y RT-PCR. De los cuatro compuestos químicos evaluados, tres inducen la síntesis de vitelogenina en las hembras cautivas, actuando de manera homóloga al estrógeno natural.
AUTORES: Moreno P ; Burgos J; Vélez P; Gutiérrez j; . Naik A; Verdugo A and Fox G.
TITULO: Multifractalidad en secuencias de ADN cromosómico.
EXPOSITORA: Patricia Velez
INSTITUCION: Department of Biology and Biochemistry College of Natural Sciences and Mathemathics. University of Houston.349 Science Building and Research II. Houston TX. USA, 77204-5513.Tel: (713) 743-8351. Fax: (713) 743-8350
pmoreno2@bayou.uh.edu

Resultados preliminares muestran que las secuencias de DNA pueden tener una estructura de correlación multifractal. Aquí, nosotros investigamos la posibilidad de que secuencias de DNA cromosómicas desplegadas en el contexto de la representación del juego del caos (CGR por sus siglas en ingles) pudieran ser modeladas mediante un enfoque multifractal. En este trabajo nosotros presentamos evidencia de la multifractalidad de las secuencias de DNA cromosómicas. Nosotros encontramos que algunos cromosomas son mas multifractales que otros y esta organización no-lineal es reflejada por el grado de multiescalaridad aperiodica de las frecuencias de oligonucleotidos sugiriendo patrones particulares de organización de los genes y el DNA repetitivo. Esto significa que amplios espectros fueron asociados con la presencia de múltiples repeticiones cortas en cromosomas de parásitos con altos contenidos de A + T y las regiones Alu en secuencias de DNA humano. Esto podría estar relacionado con "baraja" activa de genes y variaciones antigénicas para varios cromosomas de parásitos y con regiones ricas en genes para el genoma humano. Por el contrario, los espectros estrechos fueron ligados con el grado de periodicidad y restricción de los genomas dados por la organización regular en tandem de repeticiones cortas, genes en operones, o presencia de genes y pseudogenes en mosaico y las secuencias LINEs en el genoma humano. Nosotros proponemos que el análisis multifractal es una herramienta util para cuantificar y explicar los patrones estructurales por los cuales las secuencias de DNA cromosomico estan organizados como un todo.
AUTOR: Klinger J.
TITULO: Neuroinmunología: Estrés y la respuesta inmune
EXPOSITOR: Julio Klinger MD
INSTITUCION: Laboratorio de Investigaciones Inmunológicas e Infecciosas. Facultad Ciencias de la Salud-Universidad del Cauca-Popayán-Colombia.

El sistema neuroendocrino y el sistema inmune (SI) son esenciales para adaptación del individuo al medio ambiente, cualquier amenaza o estimulo estresante es corregido o contrarrestado por la respuesta de adaptación. El Sistema Inmune es influenciado por la cascada neuro-humoral circulante en el plasma generado por estrés. También es uno de los sistemas que reaccionan al estrés especialmente la inmunidad innata o inespecífica; las infecciones son estrés para el organismo cualquier reto inmunológico (infección) que amenace la estabilidad del medio interno es interpretado como estrés, denominado estrés inmune o inflamatorio que similar a otros tipos de estrés activa el eje neuroendocrino El sistema mejor estudiado en estrés es la inmunidad celular. Por muchas evidencias experimentales en humanos y animales las etapas de alarma y reacción del estrés so inmuno-estimulantes y la tercera etapa o de descompensación es inmunosupresora. Las consecuencias clí-nicas de las alteraciones inmunes generadas por estrés son variadas, principalmente la desviación de la respuesta Th1 a Th2 que tiene profundo impacto en la susceptibilidad del organismo a infecciones especialmente por gérmenes intracelulares cuya respuesta inmune es predominantemente Th1, este dato explicaría observaciones clínicas como los reportes de Thomas Holmes (1949 y 1961) indicando que los individuos que experimentaban eventos estresantes en la vida eran más susceptibles a TBC y tenían menos oportunidad de recuperarse. Aunque aún es controversial se puede especular con certeza que la reducción de la producción de IL-12 e IFN-g y el incremento de IL-10 causadas por estrés explican esas observaciones, también se ha propuesto y observado que una de las causas de progresión de la infección por VIH son los elevados niveles de cortisol que presentan los pacientes con infecciones crónicas, además proteínas accesorias del VIH (vpr) son potentes coactivadores de la expresión de receptores de corti-coides en linfocitos tornándolos más sensibles a los corticoides.
AUTOR: Ramírez F; Rodríguez, J; Barreto G.
TITULO: Eanalisis por SSCP de cuatro exones del gen BRCA 1 en 28 pacientes con cáncer de mama familiar en la ciudad de santiago de Cali.
EXPOSITOR: Francisco Javier Ramírez Biólogo
INSTITUCION: Laboratorio de Biología Molecular en humanos, Sección de Genética, Dpto. de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Valle.

Considerando la escasez de trabajos moleculares realizados con el gen BRCA1 en Colombia, la alta incidencia de cáncer mamario en Cali y la especificidad de mutaciones reportadas para cada región geográfica, se inició la caracterización molecular de la enfer-medad en esta ciudad. Se implementó la metodología de SSCP para la detección de mutaciones en dicho gen. Se analizaron 28 pacientes, pertenecientes a 19 familias, con historial de cáncer mamario hereditario. Para ello, se extrajo el ADN de sangre periférica de cada uno de ellos y se amplificaron los exones 2, 5 11d y 20, donde, de acuerdo con la literatura, se encuentran las mutaciones más frecuentes.
La técnica de SSCP aplicada con los controles apropiados a los 28 pacientes con cáncer de mama, no mostró alteraciones de secuencia en ninguno de ellos. Esto puede deberse al tamaño de la muestra, a la porción analizada del gen (un 20%) y posiblemente a la necesidad de complementar esta metodología con otras, como el análisis de heteroduplex, a objeto de aumentar su sensibilidad.
La importancia de este trabajo radica fundamentalmente en que se ha implementado una metodología eficiente y sensible para la detección de mutaciones en fragmentos de ADN en torno de los 400pb. La misma será de gran utilidad en estudios poblacionales para determinar la dinámica mutacional en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer mamario o con otro tipo de genes en Colombia.

 
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